写在前面：以前觉得我需要花很多时间去学数据分析，去学统计，学制图，现在慢慢觉得文献阅读才是整个学习中最重要的部分。统计分析跟制图，在了解了方法后在很短时间内就能掌握，但是知识体系的搭建，是需要很长的时间去积累和培养的。一个好的idea，一篇具有创新性的文章，往往是建立在阅读大量文献的基础上。阅读不同的文献，从不同角度思考问题，培养自己的批判性思维方式，构建属于自己的知识体系，需要一个很长的学习过程。这是一篇极具批判性的文章，近年来从实地调查中公布的基于序列的原生生物物种丰富度呈指数级增长，引发了一个问题，即我们是否已经超越了对物种水平多样性的表征，并开始揭示种内多样性。这个问题的答案似乎是肯定的，至少对于某些原生生物谱系而言是这样。记录这种微多样性的必要性可能是合理的，但对原生动物学家来说，认识和承认这种可能性及其后果是很重要的。

Trends in Microbiology, March 2019, Vol. 27, No. 3 https://doi.org/10.1016/j.tim.2018.10.009

我们是否高估了自然界中原生生物的多样性？

SUMMARY:

记录单细胞真核生物（原生生物）的巨大多样性对生态学家来说是一项艰巨的挑战。这些物种最初是由形态学标准定义的，但形态物种概念的缺点，以及令人眼花缭乱的大小和细胞属性，使得构建一个对生态学家有用的分类学几乎不可能。因此，生理和遗传信息已被整合解决这些缺点，并开发统一分类法的框架。特别是 DNA 序列信息，彻底改变了原生生物多样性的研究。然而，近年来从实地调查中公布的基于序列的原生生物物种丰富度呈指数级增长，引发了一个问题，即我们是否已经超越了对物种水平多样性的表征，并开始揭示种内多样性。这个问题的答案似乎是肯定的，至少对于某些原生生物谱系而言是这样。记录这种微多样性的必要性可能是合理的，但对原生动物学家来说，认识和承认这种可能性及其后果是很重要的。

Highlights

直到最近，使用传统的基于形态学的分类法才能确定自然群落中原生生物物种丰富度的全部范围，但目标基因的高通量测序 (HTS) 揭示了前所未有和意想不到的物种丰富度。

矛盾的是，最近对原生生物操作分类单元 (OTU) 数量的一些估计现在接近小样本中存在的个体原生生物的总数。许多原生生物学家在寻求充分记录自然微生物群落多样性的过程中似乎没有意识到这一悖论。

种内变异可能是许多原生生物形态种的行为和生理学的重要组成部分。

需要一条区分种间序列变异性的前进道路，包括对序列的严格质量控制和 OTU 调用方法的标准化。

Protists, Their Diversity, and Why They Are Important

单细胞真核生物（原生生物）陆地和水生环境中的许多基本生态和生物地球化学活动至关重要，包括光合作用、营养耦合、元素转化、分解和疾病。光合原生生物是世界各地重要渔业食物链的基础，而异养生物对于水、沉积物和土壤中营养元素的分解和再矿化至关重要。表征原生生物多样性对于理解它们在现代（和未来）生态系统中的生物地理学、生态学和生物地球化学意义至关重要。 此外，许多物种的化石遗骸（例如，测试、尺度等）已被用作重建古代海洋和湖泊气候条件的工具。

原生生物在真核生命树中构成了令人难以置信的形态和功能多样性，其中还包含动物、植物和真菌，尽管与单细胞生物相比，后者形成的分支相当小。它们存在于地球上几乎所有孕育生命的生态系统中，有数千种被描述的物种，包括许多化石“物种”。虽然大多数原生生物学家认为大量原生生物物种仍有待发现和描述，但有些人认为大多数主要“类型”的原生生物已经被记录在案。这些不同的观点揭示了定义原生生物物种的根本争议。

A Complicated History of Defifining Protistan Species

自从大约三个半世纪前Antonie van Leeuwenhoek发现原生生物以来，描述自然界中原生生物的多样性一直是一项艰巨的任务，今天仍然是一项艰巨的挑战。 最近的一项研究估计，我们星球上的物种丰富度超过1万亿种，当然，其中大部分是微生物物种，包括未知但很大比例的原生生物。这些估计的基础取决于将“遗传”（即基于DNA序列的）多样性与“物种”多样性等同起来。这种解释在细菌和古细菌中已经很普遍，但直到最近才被广泛应用于原生生物。基于序列的物种概念的采用较慢，部分原因是原生生物物种传统上是根据形态特征来定义的。

形态学仍然是描述原生生物物种的“黄金标准”，但将形态物种概念应用于原生生物多样性研究存在多个问题。含义模糊的物种的身体形态看起来非常相似（即，根据形态无法区分）但具有不同的生理机能（即，它们构成基于生态物种概念的不同物种）。经典的例子包括一些微小的叶绿素和金藻，它们在常规光学显微镜下几乎没有明显的形态特征，但具有不同的营养吸收能力、光照需求或生长速率。同样，具有无定形形态特征的物种，例如致病性变形虫，很难通过形态来区分，因此我们不得不依赖其他属性（即基因序列或临床表现）（图 1）。包含有性分离交配类型的难以区分的原生生物形态也混淆了原生生物形态物种的概念。“梨形四膜虫复合体”中的纤毛虫包括几种不相容的交配类型，根据生物物种概念将不相容的类型限定为物种（图 1）。此外，一些生活史复杂的原生生物在不同的生命阶段会表现出不同的形态，从而导致对同义物种的描述。原生生物形态种概念的这些许多缺点使得表征自然界中的物种多样性变得非常困难。

图1. 原生生物的问题物种概念。传统上对原生物种的定义是形态学的（它仍然是该领域的黄金标准；左上角）。然而，许多类群，尤其是微小的分类群缺乏形态学细节，导致应用综合物种概念，该概念结合了生物物种概念（上、右）、生态物种概念（左下）和最近的一些基于“遗传相似性”和系统发育亲缘关系方面的概念（右下）。这些不同类型的信息现在被结合起来产生一个综合的物种概念（中央框）。后者的努力激发了对原生生物分类群进行条形码的巨大努力，从而能够研究原生生物的多样性、分布、丰度和活动。(A) 从南极洲罗斯海的多年冰中收集到的硅藻组合（标记条 = 100 毫米）。 (B) 减数分裂后和核交换前的一对共轭四膜虫细胞。细胞核呈绿色（Sytox），纤毛虫呈蓝色（实验室制造的抗体），皮层呈洋红色（抗血清）；由 Eric Cole（美国明尼苏达州圣奥拉夫学院）提供，改编自 Turkewitz 等人。 (C) 交配四膜虫；康奈尔大学资产项目的电子显微照片；由 Quirk提供。(D) 棘阿米巴感染的眼睛显示角膜损伤和视力丧失；改编自 Siddiqui 和 Khan。(E) 荷兰淡水棘阿米巴的光学显微照片；图片由Ferry Siemensma提供。 (F) Novistrombidium testaceum的扫描电子（左）和直接干涉对比（右）显微照片（标记条 = 10 毫米）；改编自Modeo等人的图像。

对于试图使用形态种概念描述自然群落中原生生物多样性的原生生物学家来说，面临的一个实际但非常重要的问题是，为了识别所有物种，必须采用大量的协议和分类学方案。由于原生生物在大小、丰度和分类学特征上的巨大差异，基于形态学的全面分类方法几乎是不可能的。因此，生态学家特别转向 DNA 序列信息来开发一种可行的分类方法来评估原生生物多样性，但仍然允许整合多个物种概念以产生整合一系列信息的物种描述（图 1 ）。

The Double-edged Sword of Genetically Defined Protistan Species

DNA序列已成为生物学家的信息宝库。序列数据已成为解决以前与真核生物进化有关的顽固问题的核心，极大地改变了我们在过去15年中对真核生物树结构的看法。使用基因组和转录组学方法对自由生活的原生生物的生理能力和适应性进行的基于基因的研究已经开始产生关于原生生物如何感知和响应其化学、物理和生物环境变化的基本信息。

与本文相关的是，对来自自然生态系统的样本进行的基因调查在我们研究和解释原生生物物种丰富度的方式方面取得了重大进展。通过对水、沉积物和土壤的序列调查，利用传统的显微镜和培养方法发现了以前未被记录的原生生物谱系，包括有孔虫、海洋原生藻、寄生鞭毛藻和顶复体之间的新多样性。遗传方法还揭示了在大多数自然生态系统中，原生生物物种的丰富程度令人难以置信，包括大量物种以极低的丰度存在(“稀有原生生物生物圈”)，这些物种可能通过在微生物群落中提供生态冗余，在维持生态系统稳定方面发挥着作用。

近年来，原生生物多样性的遗传分析在生态学中得到了广泛的应用和认可。5-10年前采用DNA片段分析或基因克隆和测序的研究已经让位于高通量测序(HTS)，它可以快速且廉价地生成大量短序列读数。具有高度相似性的DNA序列通常会聚合到操作分类单元(OTU)中。大多数用于评估原生生物物种丰富度的方法目前都集中在核糖体RNA基因上，特别是小亚基核糖体RNA基因（ssu rDNA或18S），尽管条形码项目也检查了其他基因和内部转录间隔(ITS)区域。

这项工作中的一个默认假设是，可以将序列信息组织成 OTU，这些 OTU 大致对应于原生生物之间的物种级别差异。可以肯定的是，微生物真核生物的分子分类将具有显著的好处，特别是对于努力应对自然生态系统多样性广度的生态学家而言。不幸的是，基于所有原生生物群的序列相似性/差异性的“物种”的明确或一致的划分很难建立，这无疑是由于在短序列中所包含的有限信息，以及原体系中标记基因的进化变化率的差异所造成的。从rDNA序列中形成蛋白酶(和细菌)OTU时，通常采用97-99%的序列相似性值，但为了避免由于测序和其他错误造成OTU数量的人为膨胀，有时也会采用95%的序列相似性值。对序列数据进行分组的两种基本方法是:从头聚类和将序列与现有数据库对齐。

这些快速发展的测序技术继续揭示原生生物中越来越多的物种丰富度，远远超过以前描述或预期的传统方法。例如，Finlayet等为自由生活的纤毛虫形态的全球物种丰富度提出了一个适中的数字(000)，而HTS方法通常检测到的OTUs比形态物种多得多。这一发现并不令人惊讶，因为已经确定基于序列的纤毛虫的身份不一定与形态种评估一致，并且 HTS 可能检测到存在的分类群，其丰度可能无法通过显微镜检测。 然而，这些估计的差异之大令人担忧。

此外，遗传方法实际上低估了某些原生生物群体或谱系的物种丰富度，因此，传统方法与基于序列的方法之间的差距将随着HTS的发展而进一步扩大。由于一些常用引物与标记基因的匹配性较差，或者特别长的序列长度阻碍了PCR扩增，一些变形虫、根瘤虫、挖掘虫和异型变形虫在18S序列多样性实地调查中代表性较差。这些缺点导致使用多重方法或引物修饰来更好地评估样本中的序列多样性（以及原生生物多样性），或使用群特异性引物来估计总原生生物多样性的能力有限，但可能会更好地评估特定群体内的多样性。然而，其结果是，在引物选择、扩增协议和测序的细节上的差异，可能会产生基于DNA序列的不同物种丰富度估计，即使来自同一样本(在[48]发表的补充信息中提供了一个从单个样本集产生的可变性的例子)。

尽管存在这些警告，但 HTS 已经很容易被生态学家采用，因为它使科学家能够在雄心勃勃的时间和空间尺度上进行调查。 目前的方法导致了“揭示更多多样性更好”的口头禅，但不清楚序列多样性是揭示物种水平还是种内多样性（微多样性）。在这方面，触生藻是一个特别有趣的群体，它们的18S基因显示出极端的微多样性。尽管有证据表明测序可以提供对丰富度的估计，有时比对著名分类群（如纤毛虫）的形态学研究揭示的物种丰富度高出几个数量级，但关于原生生物高“物种”丰富度的报告现在在文献中很常见。

细菌生态学家在细菌微多样性的表征方面取得了快速进展，并且基于基因的细菌物种丰富度的非常高的估计很常见。他们的方法是明智的，因为(i)许多，也许是大多数，自由生活的分类群仍然无法培养，并且(ii)传统的细菌分类学主要基于生理学。基因序列有助于提供区分细菌“类型”的遗传特征，即表现出被认为重要的生理差异的形式。Sogin等人研究了海洋中的细菌物种丰富度，最早应用基于HTS基因的、培养无关的方法来估计微生物多样性。作者报告说，在相对较小体积的水中，细菌物种丰富度 (OTU) 估计值大于10,000。 这篇开创性的论文展示了遗传方法揭示大量细菌多样性的潜力。

目前尚不清楚原生生物学家从揭示自然界中越来越多的序列多样性的努力中获得了什么（？？？）。最重要的是，我们现在认为巨大的物种丰富度“更接近事实”，但序列多样性与生态或形态多样性之间的关系仍然不明确。最近的研究记录了在相对较小体积的水、沉积物、土壤或其他环境中存在的数千种原生生物“分类群”。在如此小的样本中找到找到这种程度的物种丰富度是否现实?有人认为，我们看到的大部分遗传多样性仅代表中性突变，即不重要的序列变异。当然，这在序列比较的某个层面上一定是正确的，因为我们很清楚，通过足够的 DNA 测序，几乎可以区分地球上的每个人（但如果应用生物物种概念，我们显然是一个物种）。以此类推，原生生物生态学家似乎已经到了这样一个地步，我们已经摆脱了无法使用传统方法对物种丰富度进行分类的问题，以面对将无信息序列差异（中性突变）与信息序列差异区分开来的艰巨任务，后者是那些与我们认为足以赋予独特科学名称的原生生物特征相对应的差异（例如，形态学、生理学或交配类型的差异）。

Objectives for Assessing Protistan Species Diversity in the Age of HTS

几个世纪以来，原生生物学家一直在努力尝试使用形态学和生理学标准来记录自然生态系统中单细胞真核生物的多样性，但收效甚微。鉴于目前和新兴的测序能力，现在和未来，原生生物生态学家面临的任务将集中在理解原生生物可用的巨大DNA序列数据集上，并将这些信息与传统识别相结合（图 1）。在某些情况下，这可能相当于在传统定义的原生生物分类群中接受相当大的序列变异性（例如，95%），而在其他情况下，实际上可能需要更高的分辨率。在所有情况下，该方法都取决于分类单元和目标。

Define and Measure the ‘Appropriate’ Level of Sequence Diversity

我们现在显然拥有评估原生生物物种丰富度的潜力（有些人可能会争论现实情况），这远远超出了使用现代遗传方法的物种水平差异，并在此过程中产生了大量没有实际意义的信息（即生态）价值。据估计，地球上有超过1030种微生物。作为生态学家，我们的目标不应该只是无休止地收集序列数据并将其拆分为无数没有生态背景或有用性的OTUs。一些研究人员似乎已经忽视了生态环境的必要性，因为他们热衷于表征越来越多的遗传多样性。值得注意的是，我们目前可以定义(没有遗传方法)的原生生物的形式和功能的多样性已经压倒了全球生物地球化学模型师。更多的多样性并不一定更好。我们是否应该继续表征越来越多的遗传多样性，因为我们可以这样做？

这个问题没有简单的答案，因为如果它为识别重要能力提供了额外的标准，那么可以有充分的理由来表征遗传微多样性（即形态种内的种内序列变异）。例如，Martens等注意到在 68 种分离的甲藻亚历山大藻菌株中产生的石房蛤毒素和螺亚胺毒素的不同类似物和数量。这种甲藻毒素产生的差异超越了形态种的概念。这些A. ostenfeldii菌株现在应该被描述为许多不同的物种还是被接受为单一物种内的变体，这是分类学家争论的主题。将每个菌株定义为不同的物种将违背长期以来的共识，即所有种群和物种都表现出一定程度的生理变异性，尽管从人类健康的角度来看，研究它们的遗传微多样性可能会揭示毒素产生的关键遗传标记(因此对生态学家和毒理学家非常有用)。

人们接受了这些令人烦恼的复杂情况，但可以合理地问，在对原生生物物种丰富度的遗传评估中，我们是否已经从“没有看到一切”迅速发展到“看到太多”。矛盾的是，最近对原生生物 OTUs 数量的一些估计现在接近于在类似大小的样本中通过显微镜观察和计数的单个原生生物细胞的总数，但从这些相同的数据集构建的 OTUs 稀疏曲线表明还有更多的 OTUs 被检测到。这些发现意味着我们正在迅速摆脱无法“看到”天然原生生物群落物种丰富度的地步，转向表征物种内应变水平差异（即微多样性）的地步。生态学家利用序列信息的关键是建立适合他们科学问题或目标的丰富度水平。

Improve Criteria for Forming Protistan OTUs

原生生物学家目前用于形成原生生物 OTUs 的标准一直是一个不断变化的目标。自从这些方法首次出现以来，生成OTUs的不一致阻碍了研究之间对原生生物丰富度估计的比较。某些数据集（例如，在实验室或工作组内）可能存在内部一致性，但目前形成OTU的方法在很多方面有所不同，包括：采样/过滤、模板存储、提取方案、基因目标/区域、引物选择和扩增方案、文库制备、测序平台、错误过滤和嵌合体检查，以及OTU调用参数。为了促进对原生生物物种丰富度和物种分布的全球（或局部）评估，非常需要一致性。与这一目标直接相关的是，序列信息将继续快速扩展，揭示原生生物群落内更多的遗传多样性。需要进一步的研究来区分各种原生生物群的种间序列变异性和种内序列变异性，包括对序列的严格质量控制和一定程度的OTU调用标准化。

幸运的是，用于形成和命名OTUs以及比较不同数据集的集中式数据库和标准化方法开始解决原生生物多样性研究之间的不可比性问题。去噪和嵌合体检测的改进、形成 OTUs 的聚类方法以及用于估计丰富度的进化模型和多样性指数的评估继续快速出现在文献中。模拟群落的使用，定义明确的物种组合，可用于审查HTS应用，然后可应用于微生物真核生物的自然组合，也将改善我们对这些强大但通常知之甚少的方法的使用。此外，许多研究人员现在承认OTUs调用的缺点（特别是缺乏一致性/可比性），并且已经提出了替代方法。扩增子序列变异(ASV)和寡核苷酸分型为检查基于序列的多样性提供了替代方法，这些方法可能会产生在研究之间更具可比性的结果，但似乎产生的生态模式与OTUs产生的类似。我们应该鼓励这种关于序列多样性的新观点，并努力在原生生物形态学和生理学的背景下理解它们的含义。

Concluding Remarks

生态学家是否应该继续使用 DNA 序列探索超越物种水平的原生生物多样性的深度？这个问题的答案是肯定的，但是这项工作应该在充分承认和公开的情况下进行。现在有越来越多的信息表明，菌株间的变异性是许多原生生物形态种生态学的重要组成部分，保证了尝试解决其中包含的重要生理差异的遗传特征。生态学家必须对原生生物的物种概念采取更细致（也更复杂）的观点（见未决问题）。相反，如果DNA序列多样性不能通过与形态、功能、次生代谢产物、行为、交配类型或其他一些被认为重要的特征的差异相关的标准来区分原生生物“类型”，那么DNA序列多样性就毫无意义。简单地定义越来越多的物种丰富度本身不应该成为我们在原生生物生态学中的分子方法的目标。应该定义有意义的多样性。