医科院药物所朱平团队基于蛋白质工程大幅提高红豆杉来源酰基转移酶对非天然底物的催化效率实现在烟草中通过非天然途径高效生物合成紫杉醇

近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由中国医学科学院药物研究所朱平团队撰写的“Engineering of 10-Deacetylbaccatin III-10-β-O-Acetyltransferase From Taxus Species for Efficient Acetylating Non-Natural Substrates Into Taxol in Nicotiana benthamiana”论文。

该研究首先以高效乙酰化10-去乙酰紫杉醇（DT）到紫杉醇为目标，通过对紫杉醇天然合成途径中的10-去乙酰巴卡亭-III-10-β-O-乙酰转移酶DBAT【其天然底物为10-去乙酰巴卡亭III（10-DAB）,产物为巴卡亭III】进行全局性蛋白质工程改造，获得了一系列对非天然底物DT的催化效率显著提高的突变体，并阐释其高效催化机制。接着，分别确证DBAT突变体和香菇来源的糖基水解酶LXYL-P1-2【该酶可高效催化紫杉醇结构类似物7-木糖-10-去乙酰紫杉醇（XDT）为DT】均能在模式植物本氏烟草体内实现功能性表达。进一步地，向瞬时转染的烟草中饲喂DT或XDT（双酶共表达），实现了以DT或XDT为前体的紫杉醇体内高效生物合成。

这一研究结果，为紫杉醇的高效生物合成提供了一条新的途径，并实现了对天然含量远高于紫杉醇的XDT的高效利用，具有较为重要的经济价值、社会意义和环保意义。同时，一系列高活性突变体的获得不仅为紫杉醇的生物合成提供了优质的元件，还为主动学习辅助的定向进化（ALDE）提供了可靠的湿实验数据。此外，基于这项研究成果，未来还可开发上述两个酶的转基因烟草细胞系，尝试通过大规模细胞培养方式生产紫杉醇。

紫杉醇是重要的一线抗肿瘤药物，但其天然含量极低，在红豆杉不同部位的含量仅为0~0.069%（干重）不等。如何充分利用红豆杉资源并绿色、高效地获得紫杉醇一直是人们关注的焦点。紫杉醇的生物合成过程复杂，且随着对其生物合成酶的不断发掘，科学家们发现紫杉醇的生物合成途径不太可能遵循简单的线性模式，而是构成了一个复杂的代谢网络，因而进一步增加了紫杉醇生物合成的整体复杂性。迄今为止，基于天然合成途径的大多数紫杉醇合成生物学研究仅实现了中间体10-DAB或巴卡亭III的从头生物合成，且其产量均远不能维持下游生物合成途径的需要。与之相对地，在紫杉醇提取过程中，常常能够获得一些天然含量远高于紫杉醇的结构类似物，其中以XDT为典型代表（~0.5%左右）。XDT仅通过C7位木糖基水解（LXYL-P1-2催化，生成DT）和C10位羟基乙酰化（DBAT催化）即可转化为紫杉醇，但其转化效率严重受限于DBAT对DT的催化效率。中国医学科学院药物研究所朱平团队在前期研究中曾获得DBATG38R/F301V突变体，该突变体与野生型DBAT相比其乙酰化DT的效率提高了约6倍（DOI: 10.1038/ncomms15544），但相比于DBAT对天然底物10-DAB的催化效率仍有很大的提升空间，另外该突变体较不稳定。本研究通过虚拟饱和突变、计算筛选，DNA改组，以及迭代组合突变相结合的蛋白质工程改造策略，获得了一系列乙酰化DT效率得到进一步提高的突变体（其中突变体ICM9-6乙酰化DT的效率大约是野生型DBAT的16.4倍）。在确证LXYL-P1-2和ICM9-6均能在烟草中实现功能性表达的基础上，通过向瞬时转染的烟草饲喂XDT或DT，分别获得3.6 μg g-1 FW（55.4 μg g-1 DW）或为8.2 μg g-1 FW（129.3 μg g-1 DW）的紫杉醇，该产量是迄今为止烟草体内生物合成紫杉醇的最高水平（图1）。

图1

全文主要研究结果如下：

1. 活性口袋“热点”氨基酸残基的虚拟饱和突变和计算筛选

研究者以来源于东北红豆杉的DBATcus作为研究对象，首先通过三维结构模拟和优化，获得了高可信度的蛋白三维结构。在此基础上与底物DT进行分子对接（图2a）。分析对接结果并排除高度保守位点后，获得了位于DT 5 Å范围内的37个“热点”氨基酸残基。对这37个位点进行虚拟饱和突变体的构建和计算机筛选，从703个虚拟单点突变体中筛选到19个对DT催化活性最有可能提高的候选突变体。对其进行突变体构建和细胞水平的活性初筛后，选择了其中12个候选突变体进行蛋白水平的活性测定，最终获得了4个对DT催化活性提高的单点突变体：P217K、E350M、S351D和S396G，催化DT的比活力分别是野生型DBATcus的2.9倍、2.8倍、2.8倍和3.9倍（图2b，2c）。正突变的比例高达1/3。在最适反应条件下（图2d，2e），P217K、E350M、S351D和S396G的催化效率（kcat/Km）比DBATcus分别提高6.1倍、1.9倍、2.9倍和6.3倍（图2f-2j）。这些结果显示，计算机辅助的虚拟筛选方法可以有效地提高筛选效率。

图2 DBATcus酰基受体底物口袋的虚拟筛选和活性测定

2. 不同红豆杉来源DBAT的DNA改组

研究者通过分析不同红豆杉来源的6种DBAT的蛋白序列和活性，发现了21个位于活性口袋之外、但与催化DT活性相关的氨基酸残基（图3a，3b）。为了集合优势突变位点、获得催化DT活性提高的突变体，研究者对这6种DBAT进行了DNA改组实验（图3c）。通过基因重组获得了约500个突变体，经过层层筛选最终对其中17个突变体进行蛋白水平活性验证（图3c，3d），结果显示有11个突变体催化DT活性与野生型DBATcus相比有所提高，实验检测阳性率高达64.7%（正文 Table S7）。其中有9个突变体的催化效率显著提高，活性最高的突变体SF-181，其催化DT的比活力为野生型DBATcus的7.9倍（图3e）。此外，研究者还发现了一个对催化活性十分重要的突变位点R345，仅对其进行R345C单点突变，即能将催化DT的比活力提高到7.4倍（图3e）。这些结果表明，远离活性中心的氨基酸残基虽然不直接参与底物的催化，但也能显著影响酶对底物的催化效率。

图3 DNA改组突变体的构建和活性测定

3. 高活性突变体的催化机制分析

在获得上述单点突变体与改组突变体基础上，研究者通过迭代组合突变，获得了催化DT的效率与野生型相比提高16.4倍（kcat/Km: 24.43 vs. 1.49）的突变体ICM9-6。为了阐释ICM9-6催化效率提高的机理，研究者对DBATcus/DT复合物和最佳突变体ICM9-6/DT复合物进行了分子动力学（MD）模拟。RMSF分析显示ICM9-6中有四个区域柔性较高（L82-E91、L130-I136、K199-L214、T343-I357）（图4a）。其中，loop K199-L214和loop T343-I357位于活性口袋的外围。与野生型DBATcus相比（图4c），loop K199-L214和loop T343-I357在ICM9-6中的柔性显著增加（图4b），从而使底物更容易进入活性口袋，最终显著提高了催化DT的效率。

图4 DBATcus/DT复合物和ICM9-6/DT复合物的分子动力学模拟分析

(a) DBATcus和 ICM9-6 中每个残基的α-碳的均方根波动（RMSF）值。ICM9-6（b）和DBATcus（c）中四个loop（L82-E91、L130-I136、K199-I224和T343-I357）的柔性示意图。高柔性以红色表示，低柔性以蓝色表示。活性口袋中的DT底物以黄色棒状显示。

4. 在本氏烟草体内以紫杉醇类似物为前体合成紫杉醇

鉴于DBATcus（及其突变体）和LXYL-P1-2在大肠杆菌（E. coli）、酿酒酵母（S. cerevisiae）、毕赤酵母（P. pastoris）和构巢曲霉（A. nidulans）系统中均未能实现功能性共表达，本研究将上述基因通过瞬时转染方式导入本氏烟草，不仅确证了DBAT突变体和LXYL-P1-2均能在烟草体内实现功能性表达，而且成功实现了DBATcus（及其突变体）与LXYL-P1-2的功能共表达，进而实现了以DT或XDT为前体的紫杉醇高效体内生物合成（图5）。饲喂XDT为底物时，紫杉醇产量为3.6μg g-1FW（55.4 μg g-1 DW）；饲喂DT为底物时，紫杉醇产量为8.2μg g-1FW（129.3 μg g-1 DW）。

图5 本氏烟草中合成紫杉醇

中国医学科学院药物研究所助理研究员陈天娇博士为该论文第一作者，朱平研究员和杨金玲研究员为该论文的共同通讯作者。该研究工作得到了北京市自然科学基金、北京协和医学院中央高校基本科研业务费专项资金、中国医学科学院医学与健康科技创新工程等项目的资助。