中国科学院微生物研究所刘宏伟课题组发表文章： Iizuchalasin A，一种罕见对称笼状结构、抗多重耐药金黄色葡萄球菌的海洋真菌新型抗生素

全球病原菌抗生素耐药问题日益突出，多重耐药金黄色葡萄球菌（包括MRSA和MDRSA）等"超级细菌"对临床治疗带来重大挑战，如何挖掘、开发化学结构新颖、作用机制独特的抗生素已成为抗感染药物研究的关键前沿。一直以来，Lipinski等人提出的类药5规则，为药物的发现提供了很好的指导，提高了药物发现效率。其中规则中规定药物的分子量应该小于500 Da，但随着抗生素的发现逐渐进入瓶颈期，而且以达托霉素、万古霉素、棘白菌素、两性霉素为代表的抗生素分子量远在500以上，这提示我们，较高分子量的天然产物，因其具有复杂的化学结构和特殊的理化性质，往往具有独特的生物活性，是潜在的天然抗生素资源。中国科学院微生物刘宏伟团队，长期致力于特殊生境（高原、海洋、肠道等）微生物活性分子发现、生物功能与作用机制研究。刘宏伟团队与沈阳药科大学合作，采用代谢组学分析、针对多重耐药病原菌的活性筛选，从一株海洋真菌Aspergillus iizukae中分离获得，具有罕见的高度对称的笼状“蝴蝶样”骨架merocytochalasan类天然产物Iizuchalasin A，该分子由两个相同的aspochalasin-epicoccine单元通过多点共价连接，形成包含17个环和32个手性中心的复杂三维结构。该分子抑制多药耐药金黄色葡萄球菌、多药耐药肺炎链球菌和万古霉素耐药肠球菌生长，对MRSA显示较强体内抗菌活性，作用靶点是磷壁酸转运蛋白TarGH胞外结构域，结合方式不同于现有的TarGH抑制剂。该分子不易诱导耐药，且耐药突变菌失去毒力和致病力，显示非常好的临床应用前景。

多重耐药金黄色葡萄球菌为靶标，对Aspergillus iizukae PJ03-11的提取物进行了活性测试，结合代谢组学分析，锁定含有中高分子量化合物的活性组分进行定向分离，获得了八个merocytochalasan类化合物，其中包括四个新化合物（1,4,5,6）。Iizuchalasin A（1）两个相同的aspochalasin-epicoccine单元通过多点共价连接，形成包含17个环和32个手性中心的罕见的高度对称的笼状“蝴蝶样”骨架，结构通过质谱、核磁共振以及X射线单晶衍射等确证。

在抗菌活性评估中，1表现出了中等强调的抗菌活性，其对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）、甲氧西林耐药金葡菌MRSA、多药耐药金葡菌MDRSA、多重耐药肺炎链球菌（MDRSP）、万古霉素耐药肠球菌（VRE）均显示出活性，对表皮葡萄球菌则无活性。值得注意的是，1对MDRSA的活性优于除万古霉素外的常用临床药物，提示其作用靶点不同现有临床抗生素。更为重要的是，电镜观察发现化合物处理阻止了细菌分裂，并可以显著促进细胞外膜囊泡分泌，提示可能作用于细菌细胞壁结构。此外，1表现出极低的诱导耐药性，且耐药突变菌失去毒力和致病力。

为了进一步确定化合物1的作用靶点，团队对一株MIC提升了8倍的突变株（ISAD30）进行全基因组测序，发现了2个截短突变基因srrB和vraG和4个点突变基因tarG（Y217D）、ybez（Y301H）、rpoA（R289C）和gdpD（G144E）。选择与细胞壁合成相关TarG（ABC转运蛋白TarGH的跨膜组分，负责壁磷壁酸前体的翻转）和GDPD（甘油磷酸二酯磷酸二酯酶）深入研究。首先在金黄色葡萄球菌中进行目标基因的过表达，结果显示过表达TarGH显著提高1的MIC（8 to 32 µg/mL），而过表达gdpD仅产生中等影响（8 to 16 µg/mL）。TarGH 作为壁磷壁酸（WTA）的翻转酶，介导 WTA 前体从细胞膜内侧向膜外侧的跨膜转运；而 TarO 是 WTA 合成途径的起始酶，催化第一步糖基转移反应。若 tarO 缺失，WTA 合成被完全阻断，TarGH 因缺乏底物而无法发挥作用，导致靶向 TarGH 的抑制剂失去抗菌活性。敲除壁磷壁酸合成途径中的tarO基因，降低了菌株对1的敏感性，MIC值提升了10倍以上，与已有的TarGH抑制剂（如targocil）的作用特征一致。TarGH基因作为必须基因无法在金黄色葡萄球菌中敲除，进一步，团队用金黄色葡萄球菌的tarGH基因替换枯草芽孢杆菌内源的tagGH基因，该重组菌对1的敏感性急剧增加16倍，直接证明了1的作用靶点是金黄色葡萄球菌来源的TarGH蛋白。

进一步的生物化学实验证实了1与TarGH的直接相互作用及其抑制活性。体外ATP酶活性实验表明，1抑制重构的TarGH复合物的ATP酶活性，IC50值为2.25 µM。微量热泳动实验则直接检测到了1与TarGH蛋白的结合，其解离常数Kd在非水解ATP类似物AMP-PNP存在下为17.1 µM，显示出比ATPγS（Kd = 31.2 µM）更强的结合能力，与已知TarGH抑制剂targocil-II的作用模式相似。基于以上综合证据，团队最终确证了TarGH是1在金黄色葡萄球菌中抑制细菌生长的一个关键靶点。

为了确定化合物在TarGH上的结合位点，对系列耐药突变株的tarG基因进行测序，发现所有菌株TarG蛋白的第217位酪氨酸（Y217）发生了点突变（主要为Y217D）。进一步分子对接和增强采样的动力学模拟提示，1的结合可能通过增加TarG蛋白EH1-EH2结构域间的角度，诱导EL-loop构象重排，从而阻塞底物运输通道，其结合主要依赖范德华力和疏水相互作用。这一位点已被报道是多种TarGH抑制剂（如targocil, targocil-II等）的耐药位点之一。结合腔附近Y217C、F82A、Y190S等突变对1的敏感性产生显著影响，对targocil影响较小。因此，由于其独特的大型笼状分子骨架，尽管我们的研究结果显示化合物1与 targocil 作用于相同的靶点，二者却呈现出不同的结合模式。

图1：化合物结构（A）、体外抑菌活性与细胞形态（B）、作用靶点（C）

图2：化合物1与TarGH的结合模式分析

在小鼠皮肤感染模型中，含1的制剂显著降低了伤口处的细菌载量。在系统性感染模型中，1能显著提高小鼠的存活率，显示出良好的体内药效。此外，由于壁磷壁酸的合成与细胞粘附和毒力密切相关，1还能抑制S. aureus对宿主细胞的粘附，并下调重要毒力因子如酚可溶性调控蛋白(PSM)和葡萄球菌A蛋白(SpA)的表达，显示出“抑细菌 抗毒力”的双重机制。

作用机制总结：

Iizuchalasin A (1) 靶向T结合于WTA 转运蛋白的跨膜亚基TarG，通过抑制其ATP 水解偶联的转运功能，阻断了胞内合成的WTA 前体向胞外的翻转，赋予1多样的抗菌作用机制。WTA 的缺失直接破坏了肽聚糖的交联和细胞壁的完整性，导致细胞壁通透性增加、形态异常（如电镜观察到的细胞壁增厚和膜泡释放），最终引起细菌裂解死亡。同时，细胞壁结构变化和环境压力，进一步激活了VraRS 双组分系统（vraR,vraS上调），下调了agr群体感应系统（Quorum Sensing）的核心基因（agrA, agrC, agrB及RNAIII），下调下游关键毒力因子的表达。这种对毒力因子的转录抑制解释了为何1能够有效阻断S. aureus对宿主细胞的粘附并降低其致死率。

靶向TarGH的新型抗生素一方面破坏细胞壁合成来“杀菌”，另一方面也可通过干扰agr信号通路来“减毒”，从而在体内表现出卓越的抗感染疗效，值得深入开发和研究。